Перед сестрами, которых на тот момент было 6 человек, стояла задача помочь больным и нуждающимся людям.
К концу 1909 г. в Обители подвизались 30 сестер, к 1918 г. их было уже 105.
Спустя год, 9 апреля 1910 г., епископ Трифон (Туркестанов) посвятил первых 17 сестер во главе с Великой княгиней в крестовые сестры. Следующим утром за Литургией митрополит Московский Владимир возвел Елизавету Феодоровну в сан настоятельницы.
Марфо-Мариинская обитель была учреждением особого рода: и не монастырь, и не обычная община сестер милосердия. В сестры принимались вдовы и девицы православного вероисповедания от 21 до 40 лет. Сестры, жившие в Обители, приносили обеты целомудрия, нестяжания и послушания. Однако, в отличие от монахинь, по истечении определенного срока они могли уйти и создать семью.
В 1911 г. в Обители действовали больница для бедных женщин и детей, дом для бедных чахоточных женщин, амбулатория, в которой бесплатно выдавали лекарства, трудовой приют для девочек, воскресная школа для взрослых женщин, бесплатные библиотека, столовая.
В обительской больнице вели прием известные в Москве врачи. Под их руководством все сестры проходили специальное обучение. Больница в Марфо-Мариинской обители считалась лучшей в Москве.
Авторитет Обители милосердия был непререкаемым, и даже события 1917 г. поначалу никак не повлияли на ее деятельность. Но в Светлый вторник, 7 мая 1918 г., за Матушкой прибыл отряд латышских стрелков. 18 июля Великая княгиня Елизавета Феодоровна и ее келейница сестра Варвара Яковлева были сброшены в шахту вблизи г. Алапаевска.
Марфо-Мариинская обитель просуществовала до 1926 г. Позднее здесь располагались кинотеатр, поликлиника, реставрационные мастерские, лаборатории.
Возрождение Обители началось в 1992 г., когда ее территория была передана Московской Патриархии.